Versuch zur Isolierung und Charakterisierung von Urease (Harnstoff-Amidohydrolase): Ein Protokoll

Praktikumsbericht / -arbeit aus dem Jahr 2016 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Ruhr-Universität Bochum (Fakultät für Chemie und Biochemie), Veranstaltung: Lehrstuhl für Biochemie II Biochemisches Grundpraktikum für Chemiker, Sprache: Deutsch, Abstract: Der Versuch G-03 befasst sich schwerpunktmäßig mit drei Aspekten. Es handelt sich um das Enzym "Urease". Weiterhin steht der optische Test im Mittelpunkt des Versuches. Weiterhin wird in weiteren Verlauf die Methode nach Bradford angewandt.Bei der Urease (Harnstoff-Amidohydrolase) handelt es sich um ein Enzym, welches als Desaminase die Hydrolyse von Harnstoff katalysiert. Dabei entstehen die primären Produkte Carbaminsäure und Ammoniak. Im weiteren Verlauf zerfällt die Carbaminsäure spontan zu Ammoniak und Kohlensäure. Das Enzym kehrt die Eliminierung des Harnstoffs um in eine Hydrolyse. Ureasen sind Nickel-Enzyme, da Nickel-Atome im aktiven Zentrum vorhanden sind, genauer gesagt handelt es sich um ein 2-Nickel-Zentrum. Die Nickel-Ionen werden über die carbamylierte Seitenkette eines Lysinrestes (Lys 220) und über ein Wassermolekül auf der anderen Seite überbrückt. Zur Bestimmung der Enzymaktivität wird im Versuch G-03 das Verfahren des gekoppelten optischen Tests mit Glutamatdehydrogenase (GLDH) verwendet. Die Methode wurde 1936 von Otto Warburg eingeführt. In diesem Verfahren wird neben der Harnstoffzersetzung durch Urease eine zweite enzymatische Reaktion mit der GLDH parallel laufen gelassen. Dabei werden -Ketoglutarat und NADH in Abhängigkeit von Ammonium zu Glutamat und NAD+ umgesetzt. Das in der ersten Reaktion gebildete Ammonium findet als Substrat Verwendung in der zweiten Reaktionen. Die Besonderheit an diesen zwei Reaktionen liegt in den verschiedenen Absorptionsspektren der Substrate und Produkte. NAD+ besitzt ein Absorptionsmaximum bei 260 nm, NADH hingegen besitzt zwei Absorptionsmaxima, und zwar bei 340 nm und bei 260 nm. Dies bedeutet, dass die Reaktionen, an denen die GLDH teilnimmt, über das Erscheinen und Verschwinden der Absorptionsbanden bei 340 nm messbar sind. Die Messung dient dann als Maß für den Reduktionsgrad von NAD+. Zur Ermittlung der spezifischen Aktivität der Urease, muss die Menge an isoliertem Protein in den Proben ermittelt werden. Dazu wird die Methode nach Bradford verwendet. Bei dem Bradford-Assay handelt es sich um eine kolorimetrische Methode zur Konzentrationsbestimmung von Proteinen. Kern des Assays ist, dass die Bindung von Coomassie Brilliant Blue an ein Protein in saurer Lösung die Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffs von 465 nm nach 595 nm verursacht. Daher ist die Absorption bei 595 nm in einem Bradford-Assay ein direktes Maß für die Proteinkonzentration.